Gibco FreeStyle™ MAX試劑（貨號16447100）
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名稱
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品牌
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貨號
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規(guī)格
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保存
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FreeStyle™ MAX試劑
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Gibco
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16447100
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1mL
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4°C
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一、產(chǎn)品概述
FreeStyle™MAX試劑是一種專有的非動物源性制劑，用于將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中，其可輕松擴大以生產(chǎn)大量重組蛋白。FreeStyle™MAX試劑可在生物生產(chǎn)應(yīng)用中獲得極高表達水平和轉(zhuǎn)染率，細(xì)胞毒性較低，并經(jīng)過特殊配制可與以下產(chǎn)品配合使用：
•無血清FreeStyle™293表達培養(yǎng)基(貨號12338-018)中的FreeStyle™293-F細(xì)胞(懸浮人胚腎細(xì)胞，貨號R790-07)。
•無血清FreeStyle™CHO表達培養(yǎng)基(貨號12651-014)中的FreeStyle™CHO-S細(xì)胞(懸浮中國倉鼠卵巢細(xì)胞，貨號R800-07)。
•含8mML-谷氨酰胺和18mL/L 10% Pluronic™F-68的CD DG44培養(yǎng)基(貨號A11000-01)中的DG44細(xì)胞(DHFR–懸浮CHO細(xì)胞)。
產(chǎn)品用途：
FreeStyle™MAX試劑預(yù)期用于與FreeStyle™MAX293表達系統(tǒng)(貨號K9000-10)和FreeStyle™MAX CHO表達系統(tǒng)(貨號 K9000-20)配合使用。
二、產(chǎn)品規(guī)格
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分類
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無動物來源
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適用于（應(yīng)用）
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轉(zhuǎn)染
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高通量能力
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不兼容高通量應(yīng)用（手動）
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產(chǎn)品線
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Freestyle™
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產(chǎn)品類型
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轉(zhuǎn)染試劑
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數(shù)量
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1mL
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血清兼容性
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是
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運輸條件
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濕冰
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細(xì)胞類型
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已建立的細(xì)胞系
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樣品類型
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質(zhì)粒 DNA
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轉(zhuǎn)染技術(shù)
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脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染
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Unit Size
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Each
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三、應(yīng)用范圍
1.適用于FreeStyle™ 293-F細(xì)胞、FreeStyle™ CHO-S細(xì)胞等懸浮培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞系。
2.用于瞬時轉(zhuǎn)染以高效表達重組蛋白，如抗體、酶、細(xì)胞因子等。
3.可用于蛋白質(zhì)功能研究、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、藥物篩選及小規(guī)模重組蛋白制備。
四、產(chǎn)品操作指南
（1）材料準(zhǔn)備
•FreeStyle™293-F細(xì)胞、FreeStyle™CHO-S™細(xì)胞或DG44細(xì)胞
•FreeStyle™293表達培養(yǎng)基、FreeStyle™CHO表達
•培養(yǎng)基或DG44培養(yǎng)基
•帶通風(fēng)瓶蓋的Erlenmeyer燒瓶
•溫度和CO 2受控培養(yǎng)箱中的軌道振蕩器
•質(zhì)粒DNA
•OptiPRO™ SFM
（2）重要指南
1.DNA-FreeStyle™MAX復(fù)合物必須在OptiPRO™SFM中制備，可直接添加至培養(yǎng)基中的細(xì)胞。
2.在濕度為37°C、CO 濃度為2%的環(huán)境中，使用軌道搖床懸浮培養(yǎng)FreeStyle™293-F和FreeStyle™CHO-S™細(xì)胞或DG44細(xì)胞。
（3）FreeStyle™細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件
•最終轉(zhuǎn)染體積：30 mL
•轉(zhuǎn)染細(xì)胞數(shù)量：3×107
•質(zhì)粒DNA量：37.5µg
•FreeStyle™MAX試劑量：37.5µL
（4）方案大綱
A. 解凍后至少傳代三次的培養(yǎng)細(xì)胞。
B. 制備并添加DNA-脂質(zhì)復(fù)合物至細(xì)胞中。
C. 將細(xì)胞培養(yǎng)1-7天。
D. 收獲。
（5）轉(zhuǎn)染FreeStyle™293-F或FreeStyle™CHO-S™細(xì)胞詳細(xì)方案
使用以下方案轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞。所有用量均以每瓶為單位給出，適用于125 mL搖瓶中的30 mL培養(yǎng)物。
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步驟
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程序詳情
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展開單元格
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對于每次30mL轉(zhuǎn)染，您需要在30mLFreeStyle™293表達培養(yǎng)基或FreeStyle™CHO表達培養(yǎng)基中加入3××107個細(xì)胞。
對于FreeStyle™293-F細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，傳代至6-7×10?個細(xì)胞/mL；以120-135rpm振搖。
FreeStyle™CHO-S ™細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，傳代至5-6×10?個細(xì)胞/mL；以120-135rpm振搖。
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細(xì)胞計數(shù)和活力測定
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用臺盼藍染色排除法測定少量細(xì)胞的活力和聚集體。用自動細(xì)胞計數(shù)器或血細(xì)胞計數(shù)板進行細(xì)胞計數(shù)。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，細(xì)胞密度應(yīng)為1.2-1.5××106個/mL，存活率>95%。
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培養(yǎng)瓶中的種子細(xì)胞
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將細(xì)胞稀釋至1×10?個/mL。每次30mL轉(zhuǎn)染需要3×107個細(xì)胞。
對于每個30mL轉(zhuǎn)染，使用新鮮、預(yù)熱的FreeStyle™293表達培養(yǎng)基或FreeStyle™CHO表達培養(yǎng)基，使總體積達到30mL。
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制備DNA-脂質(zhì)復(fù)合物
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按如下方法制備DNA-脂質(zhì)復(fù)合物：
a. 將37.5 μg質(zhì)粒DNA溶于OptPRO™SFM低濃度血清培養(yǎng)基中，使總體積為0.6mL。輕輕混合。
b. 取37.5 μL mL的FreeStyle™MAX試劑，用OptPRO™SFM稀釋至總體積為0.6mL。輕輕混合，室溫下孵育5分鐘。孵育時間超過5分鐘可能導(dǎo)致活性降低。
c. 孵育5分鐘后，將稀釋的DNA加入到稀釋的試劑中，使總體積達到1.3mL。輕輕混合。
d. 在室溫下孵育20-30分鐘，以使DNA-脂質(zhì)復(fù)合物形成。
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向細(xì)胞中添加DNA-脂質(zhì)復(fù)合物
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向每個細(xì)胞懸液瓶中加入1.2mL復(fù)合物。每瓶總體積為30mL。含有約1×10?個活細(xì)胞/mL。
向陰性對照培養(yǎng)瓶中加入2mL還原血清培養(yǎng)基，而不是復(fù)溶液。
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孵育
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溫度37℃
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濕潤的空氣 空氣中8%CO2
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軌道式振蕩臺 125 rpm
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收獲細(xì)胞或培養(yǎng)基
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重組蛋白表達檢測。在轉(zhuǎn)染后1-7天進行此步驟。如果重組蛋白是分泌的，則收集培養(yǎng)基而不是細(xì)胞。
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（6）轉(zhuǎn)染DG44細(xì)胞以生成穩(wěn)定細(xì)胞系詳細(xì)方案
使用本程序?qū)⒕€性化DNA轉(zhuǎn)染至DG44細(xì)胞。所有用量均按每瓶計算，適用于125毫升搖瓶中30毫升的培養(yǎng)物。
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步驟
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程序
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制備和培養(yǎng)DG44細(xì)胞
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a. 以3×10?個細(xì)胞/mL的密度對細(xì)胞進行傳代。
b. 在37℃下以130-135 rpm的轉(zhuǎn)速振蕩，CO含量為3%。 c. 在CD DG44培養(yǎng)基（貨號：12610-010）中進行培養(yǎng)，其中含有8 mM L-谷氨酰胺（貨號：25030-081）和18 mL/L的10% Pluronic™F-68（貨號：24040-032）。 |
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再次通過DG44細(xì)胞
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再次以3×107個細(xì)胞/mL的密度通過細(xì)胞。
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制備細(xì)胞
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細(xì)胞計數(shù)。細(xì)胞活力應(yīng)>95%。
在每個培養(yǎng)瓶中，加入1.5×106個細(xì)胞，總體積為30mL CD DG44培養(yǎng)基。 |
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脂質(zhì)與線性化DNA的結(jié)合
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輕輕翻轉(zhuǎn)試管以混合試劑，然后向1.2mL OptiPRO™SFM（室溫）中加入18μg線性化DNA和15μg FreeStyle™MAX試劑，并輕輕翻轉(zhuǎn)以混合。
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孵育DNA-脂質(zhì)混合物
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在室溫下孵育10分鐘，但不超過20分鐘。
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向細(xì)胞中添加DNA-脂質(zhì)混合物
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將1.2mL混合液緩慢加入到含有細(xì)胞的125mL燒瓶中，同時緩慢旋轉(zhuǎn)燒瓶。
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孵育
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溫度37℃
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濕潤的空氣空氣中8%CO2
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軌道式振動物臺130~135rpm
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將細(xì)胞置于選擇性培養(yǎng)基上
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將細(xì)胞置于選擇性培養(yǎng)基（例如，CD OptiCHO™培養(yǎng)基，貨號：12681-011）上。
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五、常見問題解答
1.FreeStyle Max試劑相對于293fectin轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)勢是什么？
FreeStyle Max試劑與293fectin轉(zhuǎn)染試劑能夠提供水平相近的高轉(zhuǎn)染效率；不過，F(xiàn)reeStyle Max試劑具有更低的細(xì)胞毒性，進而能夠?qū)崿F(xiàn)更高的蛋白得率。此外，F(xiàn)reeStyle Max試劑為非動物源性的。
2.培養(yǎng)于FreeStyle 293表達培養(yǎng)基中的FreeStyle 293-F細(xì)胞能使用ExpiFectamine293試劑和增強劑進行轉(zhuǎn)染嗎？如果可以，轉(zhuǎn)染效率會比使用FreeStyle Max試劑更高嗎？
您可使用ExpiFectamine293試劑來轉(zhuǎn)染FreeStyle 293表達培養(yǎng)基中培養(yǎng)的FreeStyle 293-F細(xì)胞；不過，增強劑只會對蛋白表達提供少許的促進作用，因為這一產(chǎn)品是針對更高密度培養(yǎng)設(shè)計的，而FreeStyle 293表達培養(yǎng)基并不適用。
3.我不慎將我的脂質(zhì)體試劑留在了室溫條件下，還能繼續(xù)使用嗎？
可以，我們所有的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑均能夠在室溫下穩(wěn)定保存數(shù)月。
4.反向轉(zhuǎn)染與正向轉(zhuǎn)染之間區(qū)別是什么？我該如何選擇？
在正向轉(zhuǎn)染過程中，細(xì)胞鋪于培養(yǎng)孔之中，用通常的方式制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物并在第二天將其加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。在反向轉(zhuǎn)染過程中，在培養(yǎng)孔之中制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，之后再加入細(xì)胞與培養(yǎng)基。反向轉(zhuǎn)染比正向轉(zhuǎn)染過程更迅速，因此是高通量轉(zhuǎn)染的理想之選。在非高通量的轉(zhuǎn)染操作中，通常正向轉(zhuǎn)染對于大多數(shù)類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果更佳。
5.轉(zhuǎn)染過程中的培養(yǎng)基可使用抗生素么？
可以，轉(zhuǎn)染過程中可在培養(yǎng)基中添加抗生素（青霉素-鏈霉素）。我們對多個細(xì)胞系在含與不含抗生素的培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)染效果進行了比較，同時評估其轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示并無差別。不過，某些細(xì)胞類型對轉(zhuǎn)染過程敏感或可能出現(xiàn)細(xì)胞毒性方面的問題，此時省略抗生素可能會有助于改善結(jié)果。對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，轉(zhuǎn)染操作后至少等待48小時以上，再加入選擇性抗生素。
六、內(nèi)容與儲存
每單位包含一小瓶試劑。儲存在 4°C下，請勿冷凍。妥善儲存時，保證FreeStyle™MAX穩(wěn)定儲存6個月。
七、引用和文獻
Transient transfection factors for high-level recombinant protein production in suspension cultured mammalian cells.
Authors:Liu C, Dalby B, Chen W, Kilzer JM, Chiou HC,
Journal:Mol Biotechnol
PubMed ID:18327552。
北京
