五、適用范圍
樣本類型：人外周血、臍帶血、骨髓、脾臟等組織單細(xì)胞懸液。
分離目標(biāo)：外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），包括淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞）、單核細(xì)胞等。
應(yīng)用場景：細(xì)胞分離純化、細(xì)胞表型分析、細(xì)胞培養(yǎng)、病毒分離、核酸提取、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞治療研究等。

六、儲(chǔ)存條件
儲(chǔ)存溫度：4~30℃避光保存
保質(zhì)期：未開封狀態(tài)下，3年（具體以產(chǎn)品標(biāo)簽為準(zhǔn)）
注意事項(xiàng)：避免冷凍或劇烈震蕩，開封后建議盡快使用，剩余液體需無菌操作分裝并在2~8℃保存，2周內(nèi)使用完畢。

七、使用方法（簡要流程）
樣本預(yù)處理：將抗凝血樣本（如EDTA或肝素抗凝外周血）與等量平衡液（如PBS或生理鹽水）稀釋，充分混勻。
梯度制備：取15mL離心管，緩慢加入Ficoll-Paque PREMIUM（根據(jù)樣本量，通常每10mL稀釋血樣對應(yīng)3-4mL介質(zhì)）。
樣本疊加：用吸管沿管壁緩慢將稀釋血樣疊加于介質(zhì)液面上，避免破壞密度梯度界面。
離心分離：水平轉(zhuǎn)子離心，400×g，室溫（18-22℃）離心30-40分鐘（無制動(dòng)）。
細(xì)胞收集：離心后管內(nèi)形成明顯分層，中間云霧狀白膜層即為單核細(xì)胞層，用吸管小心吸取該層細(xì)胞。
洗滌純化：將收集的細(xì)胞用平衡液洗滌2-3次（200×g離心10分鐘），去除殘留介質(zhì)與血小板，獲得純化的單核細(xì)胞。

八、詳細(xì)使用方法
（1）試劑配制
1.稀釋液與洗滌液
用于血液稀釋和細(xì)胞洗滌的平衡鹽溶液可按以下說明配制。其他稀釋液和洗滌液如等滲無鈣鎂磷酸鹽緩沖液（例如杜氏PBS）、鹽溶液（例如漢克氏液）或細(xì)胞培養(yǎng)基（例如RPMI 1640）亦可使用。
2.平衡鹽溶液
配制平衡鹽溶液時(shí)，將一份A母液與九份B母液混合后滅菌。每個(gè)樣本至少需處理20毫升。其他無菌標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液亦可使用。
3.Ficoll-Paque分離液
使用前需將Ficoll-Paque密度梯度介質(zhì)預(yù)熱至18°C至20°C。對于超過3毫升的樣本，請參閱注意事項(xiàng)。
（2）樣本制備
為確保分離的單核細(xì)胞具有高活性，應(yīng)使用新鮮血液。樣本制備需在18°C至20°C環(huán)境下進(jìn)行。
1.取10毫升離心管，加入2毫升經(jīng)去纖維蛋白或抗凝劑處理的血液，以及等體積的平衡鹽溶液（最終體積為4毫升）。
2.通過反復(fù)倒置離心管或用移液管反復(fù)抽吸混合，使血液與緩沖液充分混勻。
（3）單核細(xì)胞分離操作流程
1.充分顛倒Ficoll-Paque介質(zhì)瓶數(shù)次以確?；靹?br /> 使用注射器抽取Ficoll-Paque介質(zhì)時(shí)：折斷聚丙烯瓶蓋，將注射器針頭穿過密封隔膜
使用移液管抽取Ficoll-Paque介質(zhì)時(shí)：移除可折斷的聚丙烯瓶蓋。掀起鋁環(huán)。取下金屬密封片。移除銀色圓環(huán)。取下橡膠塞。采用無菌操作技術(shù)，吸取所需體積的Ficoll-Paque介質(zhì)。
2.向離心管中加入3ml Ficoll-Paque介質(zhì)
3.將稀釋后的血樣（4ml）小心疊加在Ficoll-Paque介質(zhì)溶液上層
重要提示：疊加樣品時(shí)切勿混合Ficoll-Paque介質(zhì)溶液與稀釋血樣
4.在18°C至20°C條件下以400g離心30至40分鐘（應(yīng)關(guān)閉離心機(jī)制動(dòng)）
5.用無菌移液管吸除含血漿和血小板的上層液，注意不要擾動(dòng)界面處的單核細(xì)胞層。含有血漿的上層液可保留備用
6.使用無菌移液管將單核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至無菌離心管
（4）洗滌細(xì)胞分離物
1.估算轉(zhuǎn)移的單核細(xì)胞體積。向離心管中的單核細(xì)胞加入至少3倍體積（約6毫升）的平衡鹽溶液。
2.通過輕柔地反復(fù)吹打使細(xì)胞懸浮。
3.在18°C至20°C條件下，以400-500×g離心10~15分鐘。
注：高速離心可提高單核細(xì)胞回收率。但若需同時(shí)去除血小板，建議采用較低離心速度（60~100×g）。
4.移除上清液。
5.將單個(gè)核細(xì)胞重懸于6至8毫升平衡鹽溶液中。
6.在18°C至20°C條件下，以400至500×g離心力（或60至100×g用于去除血小板）離心10分鐘。
7.移除上清液。
8.將細(xì)胞沉淀重懸于適合實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的培養(yǎng)基中。
（5）粒細(xì)胞分離操作流程
1.按照右側(cè)單核細(xì)胞分離流程（步驟1至6）所述方法，使用Ficoll-Paque密度梯度離心液進(jìn)行密度梯度離心。
2.用無菌移液管吸棄Ficoll-Paque離心液上層，注意不要擾動(dòng)紅細(xì)胞層上方的粒細(xì)胞白膜層。
3.用移液管收集薄層粒細(xì)胞白膜層，轉(zhuǎn)移至無菌離心管。
4.用至少五倍體積的平衡鹽溶液重懸細(xì)胞，400×g離心15分鐘。
5.使用任意選擇的紅細(xì)胞裂解液處理殘留紅細(xì)胞。
6.將粒細(xì)胞在18°C至20°C條件下以400-500×g離心10-15分鐘。
7.棄去上清液。
8.用6-8ml平衡鹽溶液重懸粒細(xì)胞。
9.在18°C至20°C條件下以400-500×g離心10分鐘。
10.棄去上清液。
11.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選用適當(dāng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。
（6）注意事項(xiàng)
1.抗凝劑：肝素、EDTA、檸檬酸鹽、檸檬酸葡萄糖（ACD）和檸檬酸磷酸鹽葡萄糖（CPD）可用作血樣抗凝劑。脫纖維蛋白血無需抗凝劑。但脫纖維化處理會(huì)導(dǎo)致單核細(xì)胞得率降低，并可能增加紅細(xì)胞污染。該過程還會(huì)造成單核細(xì)胞選擇性流失。
Bøyum研究發(fā)現(xiàn)，使用EDTA替代肝素作為抗凝劑可獲得純度略高的單核細(xì)胞制備物。另有研究指出，在從外周血以外的來源純化單核細(xì)胞時(shí)，添加肝素可能導(dǎo)致細(xì)胞懸液凝膠化。檸檬酸鹽穩(wěn)定的血樣可能比其他抗凝劑獲得更高質(zhì)量的RNA和DNA，并產(chǎn)生更高的單核細(xì)胞得率。肝素會(huì)影響T細(xì)胞增殖并與多種蛋白質(zhì)結(jié)合。EDTA適用于DNA檢測，但會(huì)干擾Mg2+濃度并影響細(xì)胞遺傳學(xué)分析。研究還顯示EDTA抗凝血比肝素抗凝血具有更高的RNA得率。
2.血量：通過使用直徑更大的離心管（同時(shí)保持與標(biāo)準(zhǔn)方法相同的Ficoll-Paque介質(zhì)層高度2.4cm和血樣高度3.0cm），可高效處理更大體積的血樣。增加離心管直徑不會(huì)影響所需分離時(shí)間。
3.血樣儲(chǔ)存：血樣應(yīng)無凝塊并在采集后盡快處理以確保******結(jié)果。延遲處理會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性喪失、回收率降低及粒細(xì)胞/紅細(xì)胞污染增加。研究表明室溫儲(chǔ)存24小時(shí)會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞得率下降、表面標(biāo)志物表達(dá)改變及有絲分裂原刺激反應(yīng)減弱。
4.死細(xì)胞去除：使用Ficoll-Paque PLUS進(jìn)行細(xì)胞分離時(shí)可去除死細(xì)胞。
5.密度與溫度：密度梯度分離的溫度受室溫、離心機(jī)溫度、密度梯度介質(zhì)溫度及液體樣本溫度影響。需注意"室溫"存在地域差異（如歐洲通常指20°C，北美則>20°C）。已知Ficoll-Paque產(chǎn)品密度隨溫度升高而降低，例如Ficoll-Paque PREMIUM（1.077 g/ml）在20°C、22°C和25°C時(shí)密度分別為1.0772、1.0767和1.0758。
6.病理血樣：上述標(biāo)準(zhǔn)方法適用于健康人外周血單核細(xì)胞純化。對于感染或癌癥等病理狀態(tài)供體的樣本可能獲得不同結(jié)果（詳見Ficoll-Paque PLUS和Ficoll-Paque PREMIUM的擴(kuò)展應(yīng)用章節(jié)第15頁）。
7.血小板去除：若需徹底清除單核細(xì)胞組分中的血小板，可在Ficoll-Paque PLUS上層疊加4%-20%蔗糖梯度進(jìn)行二次離心。該方法可有效去除血小板污染，血小板將滯留于蔗糖梯度頂部而單核細(xì)胞會(huì)沉降至Ficoll-Paque PLUS層頂部。替代方案是在分離前用5-二磷酸腺苷（ADP）誘導(dǎo)血小板聚集去除。
（7）性能故障排查
若按照推薦標(biāo)準(zhǔn)流程使用，F(xiàn)icoll-Paque PLUS和Ficoll-Paque PREMIUM應(yīng)能穩(wěn)定分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，結(jié)果如第4頁所示。如前所述，F(xiàn)icoll-Paque PREMIUM 1.073和Ficoll-Paque PREMIUM 1.084會(huì)分離出密度亞群略有差異的單個(gè)核細(xì)胞制劑。但某些實(shí)驗(yàn)參數(shù)的偏差可能導(dǎo)致結(jié)果不佳，本故障排查表旨在幫助快速識(shí)別并修正導(dǎo)致性能下降的問題。

九、包裝與運(yùn)輸
包裝：6瓶×100mL/盒，棕色玻璃瓶包裝，避光保護(hù)。
運(yùn)輸條件：2~8℃冷鏈運(yùn)輸，避免極端溫度。

十、參考文獻(xiàn)
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