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名稱
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品牌
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貨號
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規(guī)格
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保存
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高特異性qPCR試劑
TB Green® Premix Ex Taq™ II(Tli RNaseH Plus)
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TaKaRa
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RR820A
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200Rxns
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-20℃
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一、產(chǎn)品介紹
本品是采用 TB Green 嵌合熒光法進行 Real Time PCR 的專用試劑。制品中含有 Real Time PCR反應的最適濃度TB Green，是一種 2X 濃度的 Premix Type 試劑，進行實驗時，PCR 反應液的配制十分方便簡單。
本品中還添加了Tli RNaseH(耐熱性RNaseH)，以cDNA作為模板進行PCR反應時，可以很好地抑制由cDNA中殘存mRNA對PCR反應造成的阻害作用。
本品Buffer經(jīng)過改良，使反應特異性比TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)（Code No.RR420A/B）更高。能抑制非特異性反應，可以在寬廣的范圍內(nèi)進行更加準確的定量。本Buffer和Hot Start法用DNA聚合酶 TaKaRa Ex Taq HS組合使用，可以進行重復性好、可信度高的Real Time PCR解析。
二、試劑盒原理
本制品使用了改良后的TaKaRa Ex Taq HS進行PCR擴增，通過檢測反應液中TB Green的熒光強度，達到監(jiān)控PCR產(chǎn)物擴增量的目的。
1．PCR
PCR 法是以微量DNA進行目的片段擴增的方法。通過DNA鏈的熱變性、引物退火、DNA 聚合酶作用下引物的延伸三個步驟循環(huán)往復，可在短時間內(nèi)擴增DNA達100萬倍以上。本制品中的DNA聚合酶由于使用了TaKaRa Ex Taq HS，從而抑制在調(diào)制反應液等低溫條件下由引物產(chǎn)生的非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增，大大提高PCR擴增靈敏度。
2．嵌合熒光檢測法
TB Green與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，所以可以通過檢測反應體系中的TB Green熒光強度，達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的。具體原理見下圖。通過PCR反應生成雙鏈DNA，TB Green與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光，通過檢測PCR反應液中的熒光信號強度，可以對目的基因進行準確定量，同時還可以測定擴增的目的DNA片段的融解溫度。
三、產(chǎn)品性能展示
在小鼠中，暴露于蟑螂過敏原（CRA）為過敏性氣道炎癥提供了一個模型。在這個實驗中，細胞因子白細胞介素4（ IL-4 ）在小鼠接受CRA治療后的肺組織樣本中的表達進行了測量。定量PCR（qPCR）使用 TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行 使用應用生物系統(tǒng)7500實時PCR系統(tǒng)。TB Green Premix Ex Taq II 試劑盒提供了準確的基因表達測量，使相對 IL-4 誘導水平在CRA中的量化。
結(jié)核分枝桿菌綠色 預混劑 Ex Taq II酶高效特異地擴增小鼠 IL-4 和 GAPDH 控制。 IL-4 的相對表達 在 CRA 處理的肺樣本中比 PBS 處理的樣本高。
IL-4 的相對表達水平 由 qPCR 確定。 IL-4 的 表達倍數(shù) （與 GAPDH 相比）在 PBS 或 CRA 處理的小鼠肺樣本中。
細胞因子IL-4的上調(diào)與過敏癥有關。預計IL-4的表達會在CRA誘導的過敏性氣道炎癥模型中增加。事實上，使用TB Green Premix Ex Taq II，相對增加IL-4基因在小鼠的肺樣本中準確檢測到，這些小鼠對CRA敏感并受到挑戰(zhàn)。TB Green Premix Ex Taq II提供了對基因表達的敏感和準確檢測。
TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNase H Plus）是實時PCR實驗的理想選擇，其中特異性是關鍵。通過有效抑制底物二聚體和非靶標產(chǎn)物的擴增，可以實現(xiàn)并保持跨樣品的高精度。這種試劑適用于已經(jīng)優(yōu)化了引物設計，但仍需要提高qPCR特異性的情況。
在這項研究中，轉(zhuǎn)錄因子E2F1的mRNA 水平在轉(zhuǎn)染了實驗或?qū)φ召|(zhì)粒的HEK293細胞中進行了分析。該協(xié)議使用TB Green Premix Ex Taq II（Cat。# RR820Q）在StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific）上進行，使用30秒的延伸步驟。
熔解曲線分析表明對E2F1和GAPDH控制的特異性很高（圖1，底部面板）。使用Delta delta Ct方法對原始數(shù)據(jù)進行相對量化。這個分析（圖2）顯示在E2F1沒有顯著差異。樣本之間的mRNA水平，表明 TB Green 母液能夠在低樣本間變異的情況下提供可靠的結(jié)果。
圖1。放大曲線（頂部）和熔解曲線（底部）為E2F1和GAPDH（內(nèi)源性控制）。
圖2。相對定量分析E2F1mRNA在轉(zhuǎn)染了對照質(zhì)粒和聚焦基因A質(zhì)粒的HEK293細胞中的水平。
使用TB Green Premix Ex Taq II在實時PCR結(jié)果中獲得了高特異性和低樣本間變異性。這種預混劑在測試條件下提供了穩(wěn)定的結(jié)果。
四、產(chǎn)品內(nèi)容（Code No.: RR820A:50 μl 反應×200 次）
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TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×Conc.）*1
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1.0ml×5支
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ROX Reference Dye（50×Conc.）*2
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200μl×1支
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ROX Reference Dye II（50×Conc.）*2
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200μl×1支
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*1 內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，TB Green。
*2 ROX Reference Dye是用以校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號誤差。例如使用 Applied Biosystems的Real Time PCR 擴增儀進行實驗就需要校正。
◆ 需要使用 ROX Reference Dye 校正的儀器
Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific）
Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)
◆ 需要使用 ROX Reference Dye II 校正的儀器
Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific)
◆ 不需要校正的儀器
Thermal Cycler Dice™ Real Time System series (Code No. TP950，etc.，TP700/TP900：終賣)
LightCycler/LightCycler 480 System (Roche Diagnostics)
CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)
五、保存
4℃可保存 6 個月。
避光保存，避免污染。
長期保存請置于-20℃。產(chǎn)品融解后請于 4℃保存，并在 6 個月內(nèi)用完。
六、使用注意事項
以下為使用本試劑盒時的注意事項，使用前一定認真閱讀。
1．使用時請上下顛倒輕輕均勻混合，避免產(chǎn)生氣泡，防止因混合不均勻造成的反應不足。
a) 請勿渦旋振蕩混勻。
b) TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2X conc.)在-20℃存放可能會產(chǎn)生白色或淡
黃色的沉淀，可用手握緩慢溶解，于室溫短時間避光放置，輕柔上下顛倒混勻直至沉淀全部消失。
c) 沉淀會導致溶液成分不均勻，使用前務必充分混勻試劑。
2．配制反應液時，試劑請于冰上放置。
3．本制品中含有熒光染料 TB Green，配制 PCR 反應液時應避免強光照射。
4．反應液的配制、分裝請一定使用新的（無污染的）槍頭、Microtube 等，盡量避免污染。
七、操作方法（請按照不同儀器的操作手冊提供的方法操作）
（1）應用Thermal Cycler Dice Real Time System series 擴增儀的操作方法
1.按下列組份配制PCR反應液（反應液配制請在冰上進行）。考慮到吸取誤差，配置的預混液體積要至少多于所有反應用總體積的10%。
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試劑
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使用量
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終濃度
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TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）(2X)
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12.5μl
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1X
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PCR Forward Primer (10μM)
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1μl
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0.4μM*1
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PCR Reverse Primer (10μM)
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1μl
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0.4μM*1
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DNA模板(<100 ng)*2
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2μl
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滅菌水
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8.5μl
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Total
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25μl*3
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?通常引物終濃度為0.4μM可以得到較好結(jié)果。反應性能較差時，可以在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
?在25μl的反應體系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，確定合適的DNA模板添加量。另外，2 Step RT-PCR反應的cDNA（RT反應液）作為模板時的添加量不要超過PCR反應液總體積的10%。
?建議反應液體積為25μl。
2.進行Real Time PCR反應。
建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應程序。由于使用Tm值較低的引物等原因，兩步法PCR反應擴增性能較差時，可以嘗試進行三步法PCR擴增反應。有關PCR的具體反應條件請參照「實驗條件的選擇」。
兩步法PCR擴增標準程序：
Hold(預變性)
Cycle:1
95℃ 30秒
PCR反應
Cycle:40
95℃ 5秒
60℃ 30秒
Dissociation
◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應前的95℃、5-15分鐘的酶的活性化反應。如果高溫處理時間過長，會使酶的活性下降，其PCR的擴增效率、定量準確度等都會受到影響。如果在PCR反應前進行模板的預變性，通常設定為95℃、30秒。
3.實驗結(jié)果分析。
反應結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。分析方法參見儀器操作手冊。
（2）應用Applied Biosystems7300/7500/7500Fast Real-Time PCR System和StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法
1.按下列組份配制PCR反應液（反應液配制請在冰上進行）。考慮到吸取誤差，配置的預混液體積要至少多于所有反應用總體積的10%。
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試劑
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使用量
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使用量
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終濃度
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TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2X)
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10μl
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25μl
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1X
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PCR Forward Primer (10 μM)
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0.8μl
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2μl
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0.4μM*1
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PCR Reverse Primer (10 μM)
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0.8μl
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2μl
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0.4μM*1
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ROX Reference Dye (50X) orROX Reference Dye II (50X)*2
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0.4μl
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1μl
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1X
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DNA模板*3
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2μl
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4μl
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滅菌水
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6μl
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16μl
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Total
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20μl*4
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50μl*4
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?通常引物終濃度為0.4 μM可以得到較好結(jié)果。反應性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
?ROX Reference Dye II（50X）比ROX Reference Dye（50X）濃度低，使用ABI 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System時，請使用ROX Reference Dye II（50X）。使用ABI 7300和StepOnePlus Real-Time PCR System時，請使用ROX Reference Dye（50X）。
?在20 μl反應體系中，DNA模板的添加量通常在100 ng以下。因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，確定合適的DNA模板添加量。另外，2 Step RT-PCR反應的cDNA（RT反應液）作為模板時的添加量不要超過PCR反應液總體積的10%。
?按照各儀器推薦體系進行反應液配制。
2.進行Real Time PCR反應。
建議采用下列圖表顯示的兩步法PCR反應程序，如果該程序得不到良好的實驗結(jié)果時，再進行PCR條件的優(yōu)化。由于使用Tm值較低的引物等原因，兩步法PCR反應擴增性能較差時，可以嘗試進行三步法PCR擴增反應。有關PCR的具體反應條件請參照「實驗條件的選擇」。
< Applied Biosystems 7300/7500和StepOnePlus Real-Time PCR System >兩步法PCR擴增標準程序：
Stage 1：預變性
Reps：1
95℃ 30秒
Stage 2：PCR反應
Reps：40
95℃ 5秒
60℃ 30～34秒*
Dissociation stage
* 使用StepOnePlus 時請設定在30秒。
使用7300時請設定在31秒。
使用7500時請設定在34秒。
< Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System >兩步法PCR擴增標準程序：
Stage 1： 預變性
Number of Cycles：1
95℃ 30秒
Stage 2： PCR反應
Number of Cycles：40
95℃ 3秒
60℃ 30秒
Melt Curve Stage
◆特別提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗體的Hot Start用DNA聚合酶，與其他公司的化學修飾型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反應前的95℃、5-15分鐘的酶的活性化反應。如果高溫處理時間過長，會使酶的活性下降，其PCR的擴增效率、定量準確度等都會受到影響。如果在PCR反應前進行模板的預變性，通常設定為95℃、30秒。
3.實驗結(jié)果分析。
反應結(jié)束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，進行PCR定量時制作標準曲線等。分析方法請參考儀器的操作手冊。
八、實驗條件的選擇
如果按照推薦的兩步法條件進行反應，反應性能不好時，請按照下面的方法進行引物和 PCR 反應條件的研討。另外，根據(jù)反應情況選擇特異性不同的Perfect Real Time系列試劑(Code No. RR420Q/A/B,RR430A/B,RR091A/B)，可提高PCR 反應性能。
實驗條件選擇時，請從反應特異性與擴增效率兩方面進行綜合考慮。要求能同時滿足這兩個條件的反應
體系，并可以在較大濃度范圍內(nèi)進行很好的定量。
?反應特異性高的實驗體系應具備以下條件：
No Template Control 時不產(chǎn)生引物二聚體等非特異性擴增。
不產(chǎn)生目的片段以外的擴增。
? 擴增效率高的實驗體系應具備以下條件：
擴增產(chǎn)物起峰更早（Ct 值小）。
PCR 擴增效率高（接近理論值 100％）。
1. Primer 濃度與反應性能間的關系如下：
降低 Primer 濃度有助于提高特異性；提高 Primer 濃度有助于提高擴增效率。圖示如下：
2. PCR 條件與反應性能間的關系如下：
① 要提高反應特異性，可以提高退火溫度。
② 要提高擴增效率，可以增加延伸時間或變?yōu)?3 Step PCR 反應。
③ 預變性。
預變性條件通常設定為 95℃ 30 sec，使用此條件對于難變性的環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 和基因組 DNA 模板
基本上也能夠很好的變性。如果對難變性的模板想改變變性條件，可以延長至 1～2 分鐘。但是時
間過長酶容易失活，不推薦使用 2 分鐘以上的變性條件。
3. 各種試劑與反應性能間的關系如下：
Takara Bio提供幾種不同的TB Green嵌合法real-time PCR試劑，這些試劑的反應特異性以及擴增效率間
有以下關系。 TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)（Code No. RR420Q/A/B）和TB Green Fast
qPCR Mix (Code No. RR430A/B)是擴增效率與反應特異性綜合性較好、通用性高的試劑，但是，如果想
提高反應特異性，使用TB Green Premix DimerEraser™(Perfect Real Time)（Code No. RR091A/B）
和TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820Q/A/B)則更有效。
九、參考文獻
1. Qu CM, Fu FY, et al. Differential accumulation of phenolic compounds and expression of related genes in black-and yellow-seeded Brassica napus. J Exp Bot. 2013 Jul;64(10):2885-98.
2. Xia ZL, Wei YY, et al. The Maize AAA-Type Protein SKD1 Confers Enhanced Salt and Drought Stress Tolerance in Transgenic Tobacco by Interacting with Lyst-Interacting Protein 5. PLOS ONE. 2013 Jul 24;8(7):e69787.
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北京
