Qiagen 47014/47016強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒（50T/250T）

名稱	品牌	貨號	規(guī)格	保存
強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒 DNeasy PowerSoil Pro Kits	Qiagen	47014	50T	RT
		47016	250T

 

一、產(chǎn)品詳情

從土壤樣本中提取微生物DNA可能具有挑戰(zhàn)性。QIAGEN的新型DNeasy PowerSoil Pro Kit比我們原創(chuàng)的PowerSoil技術(shù)更有效地從所有土壤類型（包括堆肥，粘土和表土）中分離出高產(chǎn)的純微生物DNA。該試劑盒具有新穎的珠管和優(yōu)化的化學(xué)成分，可更有效地裂解土壤細(xì)菌和真菌。 該試劑盒還包含簡化的抑制劑去除技術(shù)（IRT），可在更短的時間內(nèi)消除土壤和環(huán)境樣品中常見的具有挑戰(zhàn)性的抑制劑。測序結(jié)果顯示，與其他測試方法相比，通過觀察到的操作分類單位（OTU）測量的α多樣性更高。使用DNeasy PowerSoil Pro Kit提取DNA可以在QIAcube Connect上自動進(jìn)行。

二、產(chǎn)品特征

?高效分解所有土壤類型中的細(xì)菌和真菌

?與替代方法相比,DNA產(chǎn)量提高了8倍

?回收不含抑制劑的DNA，直接用于NGS應(yīng)用

?無偏結(jié)果準(zhǔn)確代表樣本a多樣性

?QIAcube連接的自動化

?可選的UCP MinElute色譜柱，用于從低生物量樣品中濃縮DNA

三、產(chǎn)品性能展示

（1）顯著提高具有挑戰(zhàn)性樣品的DNA產(chǎn)量

DNeasy PowerSoil Pro 試劑盒包括一種新型磁珠管和改進(jìn)的裂解化學(xué)方法，與第一代 DNeasy PowerSoil 試劑盒和所有測試土壤類型中的競爭對手相比，分離出的DNA產(chǎn)量提高了 8 倍（圖1）。

 

圖1:分離出更多高質(zhì)量的基因組DNA。

使用市售樣品制備溶液制備250 mg三種不同類型的土壤，并與新的DNeasy PowerSoilPro試劑盒進(jìn)行比較。DNeasy PowerSoilPro試劑盒的性能優(yōu)于其他可用的試劑盒，在各種土壤類型中的DNA回收率提高了8倍。

 

 

DNeasy PowerSoil 試劑盒和新型 DNeasy PowerSoil Pro 試劑盒均從具有挑戰(zhàn)性的土壤類型中分離出高質(zhì)量的 DNA（圖2）。

 

 

圖2:使用新的DNeasy PowerSoil Pro試劑盒提高了高質(zhì)量的DNA產(chǎn)量。

凝膠A顯示了與DNeasy PowerSoil Pro試劑盒(b)相比，用DNeasy PowerSoil試劑盒(A)處理的1.8ml白色念珠菌真菌培養(yǎng)物。凝膠B和C含有各種土壤樣品(250毫克)。凝膠B用原來的DNeasyPowerSoil試劑盒處理，而凝膠C用DNeasyPowerSoil Pro試劑盒處理。如更強(qiáng)的凝膠帶所證明的，使用DNeasy PowerSoil Pro試劑盒從樣品中分離出更高的DNA產(chǎn)量。

 

 

（2）無偏鑒定土壤樣品中的總體多樣性和群落代表性

與DNeasy PowerSoil Kit和兩個競爭對手的DNA相比，使用DNeasy PowerSoil Pro Kit分離的DNA在土壤樣品中鑒定出更多的細(xì)菌（OTU）（圖3）。

 

 

圖3:使用新的DNeasy PowerSoilPro試劑盒增加了細(xì)菌OTUs。

用不同的方法從土壤樣品中提取DNA并富集。16S rRNA基因的分析使用QIAseq一步擴(kuò)增子試劑盒進(jìn)行，數(shù)據(jù)分析使用微生物基因組Pro套件(CLC workbench)進(jìn)行。α多樣性通過細(xì)菌操作分類單位(OTUs)的總數(shù)來確定。在用DNeasy PowerSoil Pro試劑盒處理的樣品中發(fā)現(xiàn)了******的多樣性。

 

 

（3）抑制劑去除技術(shù)提高分離DNA的純度

DNeasy PowerSoil Pro 試劑盒采用簡化的抑制劑去除技術(shù) （IRT），可縮短樣品處理時間。在比較從土壤中分離DNA的方法時，DNeasy PowerSoil Pro Kit是唯一一種在所有土壤類型中顯示260/280比率接近1.8的方法，以及最高的260/230比率，表明沒有抑制劑。與競爭對手的方法相比，使用該試劑盒分離的樣品在PCR中也沒有抑制作用。（圖4）

 

 

圖4:使用DNeasy PowerSoil Pro試劑盒提取的DNA純度提高，變異性降低。

使用市售樣品制備溶液制備土壤樣品(每份250 mg),并與新的DNeasy PowerSoil Pro試劑盒進(jìn)行比較。DNA純度通過UV測量和A260/A280、A和A260/A230比率的分析來描述。B.使用抑制劑敏感型PCR和添加了Purelink Microbiome DNA純化試劑盒和DNeasy PowerSoil Pro試劑盒洗脫液的內(nèi)部質(zhì)控品，觀察抑制劑的去除情況。

無洗脫液反應(yīng)用作內(nèi)部對照，c.與其他不抑制PCR的樣品制備試劑盒相比，使用DNeasyPowerSoil Pro試劑盒提取的DNA顯示出純度增加。

 

四、試劑盒組份表

 

DNeasy PowerSoil Pro試劑盒 目錄號 制備次數(shù)	(50)	(250)
	47014	47016
	50	250
PowerBead Pro Tubes	50	250
MB Spin Columns	50	250
Solution CD1	40 ml	200 ml
Solution CD2	15 ml	60 ml
Solution CD3	35 ml	175 ml
Solution EA	36 ml	175 ml
Solution C5	30 ml	175 ml
Solution C6	9 ml	66 ml
Microcentrifuge Tubes (2 ml)	100	500
Elution Tubes (1.5 ml)	50	250
Collection Tubes (2 ml)	100	500
Quick-Start Protocol	1	1

 

五、簡單程序

土壤或糞便樣品通過化學(xué)和機(jī)械均質(zhì)化進(jìn)行溶解。將裂解緩沖液添加到含有樣品的混合鋯珠管中。可以使用帶珠管適配器的標(biāo)準(zhǔn)臺式渦旋或高性能Powerlyser進(jìn)行珠粒打漿。然后對粗裂解物進(jìn)行抑制劑去除以進(jìn)行凈化。純化后，將純化的裂解物與等體積的DNA結(jié)合溶液混合，并通過二氧化硅旋轉(zhuǎn)濾膜。用兩步洗滌方案洗滌膜。然后用10mM Tris洗脫緩沖液洗脫二氧化硅結(jié)合的DNA。分離的DNA的相關(guān)下游應(yīng)用包括PCR、NGS和酶消化分析。

 

六、方案：有經(jīng)驗(yàn)的用戶 

（1）開始前的重要注意事項(xiàng) 

?確保PowerBead Pro試管在離心機(jī)中自由旋轉(zhuǎn)，無摩擦。

?如果CD3溶液已沉淀，則加熱至60°C直至沉淀溶解。

?在室溫（15-25°C）下進(jìn)行所有離心步驟。

 

（2）程序 

1. 短暫旋轉(zhuǎn)PowerBead Pro管，確保磁珠沉降到底部。加入最多250毫克土壤和800µl的CD1溶液。短暫         渦旋混合。

2. 將PowerBead Pro管水平固定在1.5-2ml管的渦旋混合器適配器上（貨號：13000-V1-24)。以******速

度進(jìn)行渦旋處理10分鐘。

注：如果同時使用渦旋適配器進(jìn)行超過12次制備，則將渦旋時間延長5-10分鐘。

注：有關(guān)樣品均質(zhì)化的其他方法，請參見第13-14頁的詳細(xì)方案。

3. 以15,000 x g對PowerBead Pro管進(jìn)行離心1分鐘。

4. 將上清液轉(zhuǎn)移至潔凈的2 ml微量離心管（提供）。注意：預(yù)期為500-600µl。上清液中可能仍含有少量           泥土顆粒。

5. 加入200µl CD2溶液，渦旋振蕩5秒。

6. 在15,000 x g下離心1分鐘。避開沉淀，將最多700µl的上清液轉(zhuǎn)移至潔凈的2ml微量離心管（提供）。

注：預(yù)期值為500-600µl。

7. 加入600µl CD3溶液，渦旋振蕩5秒。

8. 將650µl裂解液加載至MB離心柱中，以15,000 x g的轉(zhuǎn)速離心1分鐘。

9. 丟棄穿流液，重復(fù)步驟8以確保所有裂解液都通過MB離心柱。

10. 小心地將MB離心柱放入潔凈的2 ml收集管（提供）中。避免任何洗脫液濺到MB離心柱上。

11. 向MB離心柱中加入500µl溶液EA。以15,000 x g離心1分鐘。

12. 棄去流穿液，將MB離心柱放回同一2 ml收集管中。

13. 向MB離心柱中加入500µl溶液C5，以15,000 x g離心1分鐘。

14. 棄去穿流液，將MB離心柱放入新的2ml收集管（提供）。

15. 以高達(dá)16,000 x g的轉(zhuǎn)速離心2分鐘。小心地將MB離心柱放入新的1.5 ml洗脫管（提供）中。

16. 將50一100µl的溶液C6加入白色濾膜中心。

17. 在15,000 x g下離心1分鐘。棄去MB離心柱。此時DNA已準(zhǔn)備好用于下游應(yīng)用。

注：由于溶液C6不含EDTA，我們建議將DNA冷凍保存（一30至一15°C或一90至一65°C）。如需濃縮DNA，請參閱故障排除指南。

 

七、方案：詳細(xì) 

（1）開始前的重要注意事項(xiàng) 

?確保PowerBead Pro試管在離心機(jī)中自由旋轉(zhuǎn)，無摩擦。

       ?如果CD3溶液已沉淀，則加熱至60°C，直至沉淀溶解。

   ?在室溫（15-25°C）下進(jìn)行所有離心步驟。 

 

（2）程序 

1. 短暫旋轉(zhuǎn)PowerBead Pro管，確保磁珠沉降到底部。加入最多250mg土壤和800µlCD1溶液，渦旋混           勻。

注意：當(dāng)樣本裝入PowerBead Pro管后，下一步需進(jìn)行均質(zhì)化和裂解處理。該管內(nèi)含緩 沖液，其功能包括：

       (a)幫助分散土壤顆粒；(b)開始溶解腐殖酸；(c)保護(hù)核酸免受降解。通過輕柔渦旋混勻，可使樣本成分在         緩沖液中充分混合并分散。

2. 使用以下方法之一對樣品進(jìn)行徹底均質(zhì)化：

2a.將PowerBead Pro管水平固定在渦旋混合器適配器上（適用于1.5-2毫升試管，貨號13000-V1-24)。以******速度渦旋10分鐘。

注：如果同時使用渦旋適配器進(jìn)行12次以上制備，則將渦旋時間延長5-10分鐘。

注：使用Vortex Adapter將******程度地提高均質(zhì)化，從而獲得更高的DNA產(chǎn)量。避免使用膠帶，因?yàn)槟z帶會變得松動，導(dǎo)致均質(zhì)化效率降低、結(jié)果不一致和產(chǎn)量降低。

2b.使用PowerLyzer 24勻漿儀。PowerBead Pro試管需正確平衡在PowerLyzer24勻 漿儀的試管架中。我們建議以2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度勻漿土壤30秒，暫停30秒后，再次以2000轉(zhuǎn)/分鐘的速度勻漿30秒。

注：以更高轉(zhuǎn)速（高達(dá)4000 rpm)對樣品進(jìn)行均質(zhì)化處理可能會增加產(chǎn)量，但會導(dǎo)致DNA碎片增多。

2c.使用TissueLyser II。將PowerBead Pro管放入TissueLyser適配器組中使用2×24（貨號69982)或2毫升試管架（貨號11993)及培養(yǎng)皿適配器套裝（貨號11990)。將適配器旋緊至儀器，以25 Hz轉(zhuǎn)速搖晃5分鐘。調(diào)整適配器方向，使原 本靠近機(jī)器機(jī)身的一側(cè)移至最遠(yuǎn)離機(jī)器的一側(cè)。再次以25 Hz轉(zhuǎn)速搖晃5分鐘。

注：渦旋/振蕩對于完全均質(zhì)化和細(xì)胞裂解至關(guān)重要。通過步驟1的化學(xué)試劑與本步驟引入的機(jī)械振蕩相結(jié)合的方式裂解細(xì)胞。在含有破碎劑的環(huán)境中隨機(jī)振蕩微珠，將導(dǎo)致微珠與微生物細(xì)胞碰撞并使細(xì)胞破裂。

3. 以15,000 x g對PowerBead Pro管進(jìn)行離心1分鐘。

4. 將上清液轉(zhuǎn)移至潔凈的2 ml微量離心管（提供）。注意：預(yù)期為500-600µl。上清液中可能仍含有少量泥土顆粒。

5. 加入200µl CD2溶液，渦旋振蕩5秒。

注：溶液CD2含有IRT，IRT是一種能夠沉淀非DNA有機(jī)物和無機(jī)物的試劑，包括腐殖質(zhì)、細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)等，必須去除可能降低DNA純度并抑制DNA下游應(yīng)用的污染性有機(jī)物和無機(jī)物。

6. 在15,000 x g下離心1分鐘。避開沉淀，將最多700µl的上清液轉(zhuǎn)移至潔凈的2ml微量離心管（提供）。

注：預(yù)期值500一600µl。

注：此時的沉淀物包含非DNA有機(jī)和無機(jī)物質(zhì)，包括腐殖酸、細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)。為獲得******的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量，請避免轉(zhuǎn)移任何沉淀物。

7. 加入600µl CD3溶液，渦旋振蕩5秒。

注：溶液CD3是一種高濃度鹽溶液。由于DNA在高鹽濃度下與二氧化硅緊密結(jié)合，因此溶液CD3將調(diào)節(jié)DNA溶液的鹽濃度以允許DNA結(jié)合，但可能仍存在的少量非DNA有機(jī)和無機(jī)物則不能與MB離心柱濾膜結(jié)合。

8. 將650µl的裂解液加載至MB離心柱上，并以15,000×g的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心1分鐘。

注：在高鹽溶液存在時，DNA被選擇性結(jié)合到MB旋柱中的硅膠膜上。污染物通過濾膜，只留下與膜結(jié)合         的DNA。

9. 丟棄穿流液，重復(fù)步驟8以確保所有裂解液都通過MB離心柱。

10. 小心地將MB離心柱放入潔凈的2 ml收集管（提供）中。避免任何洗脫液濺到MB離心柱上。

11. 向MB離心柱中加入500µl EA溶液。以15,000 x g離心1分鐘。注：EA溶液是一種洗脫緩沖液，用于清除MB離心柱濾膜上的蛋白質(zhì)和其他非水性污染物。

12. 棄去流穿液，將MB離心柱放回同一2 ml收集管中。

13. 向MB離心柱中加入500µl溶液C5，以15,000×g離心1分鐘。注意：溶液C5是一種乙醇基洗滌液，用于進(jìn)一步清洗MB離心柱中與硅膠濾膜結(jié)合的DNA。該洗滌液可去除殘留的鹽分、腐殖酸及其他污染物，同時確保DNA仍與硅膠膜保持結(jié)合。

14. 棄去穿流液，將MB離心柱放入新的2 ml收集管（提供）。

15. 以高達(dá)16,000 x g的轉(zhuǎn)速離心2分鐘。小心地將MB離心柱放入新的1.5 ml洗脫管（提供）中。

注：此步驟可去除殘留的溶液C5。必須徹底去除所有溶液C5的痕跡，因?yàn)槠渲械囊掖紩蓴_下游DNA應(yīng)用，例如PCR、限制性酶切和凝膠電泳。

16. 將50-100µl溶液C6加入白色濾膜中心。

注意：將溶液C6置于白色小膜中央，可確保整個膜層充分濕潤。這能更高效、完整地從MB離心柱濾膜中釋放DNA。當(dāng)溶液C6流經(jīng)硅膠膜時，原本在高鹽環(huán)境中結(jié)合的DNA會被不含鹽分的溶液C6（10 mM Tris）選擇性釋放。

17. 在15,000 x g下離心1分鐘。棄去MB離心柱。此時DNA已準(zhǔn)備好用于下游應(yīng)用。

注：由于溶液C6不含EDTA，我們建議將DNA冷凍（-30至-15°C或-90至-65°C）儲存。如需濃縮DNA，請參閱故障排除指南。

 

 

八、故障排除指南

（1）意見和建議 

1.土壤處理 

a) 待處理的土壤量 

QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro試劑盒設(shè)計(jì)用于處理0.25 g土壤。如需了解 有關(guān)使用更大樣本量的建議，請聯(lián)系技術(shù)支持部門。

b) 土壤樣品含水量高 

從PowerBead Pro管（磁珠）中取出內(nèi)容物，轉(zhuǎn)移至另一支無菌微量離心管（未提供）。將土壤樣本加入PowerBead Pro管后，在室溫（15一25°C）下以10,000×g離心30秒。用移液槍頭盡可能吸除液體。重新加入磁珠至Powe

rBead Pro管，繼續(xù)執(zhí)行步驟2的實(shí)驗(yàn)流程。

 

2.脫氧核糖核酸 

a) DNA未擴(kuò)增，請通過凝膠電泳或分光光度計(jì)讀數(shù)來檢查DNA產(chǎn)量。過量的DNA會抑制PCR反應(yīng)。使用DNeasy PowerSoil Pro DNA試劑盒分離的DNA不應(yīng)需要稀釋模板DNA。但是，仍應(yīng)嘗試稀釋。如果在嘗試上述步驟后，DNA仍無法擴(kuò)增，則可能需要進(jìn)行PCR優(yōu)化。

b)洗脫DNA為棕色如果在樣品中觀察到顏色，請聯(lián)系技術(shù)支持以獲取建議。 

c)濃縮洗脫DNA：最終洗脫DNA的體積為50-100µl。通過加入5-10µl 3M氯化鈉溶液并反復(fù)振蕩3-5次進(jìn)行濃縮。隨后加入100µl 100%預(yù)冷乙醇，再次振蕩3-5次混合。將混合液置于-30至-15°C環(huán)境中孵育30分鐘，隨后在室溫下以10,000×g離心5分鐘。棄去所有液體后，用真空干燥機(jī)或自然風(fēng)干殘留乙醇。注意避免沉淀過度干燥，否則可能難以重新懸浮。最后將沉淀的DNA用10mMTris緩沖液（溶液C6)按所需體積重新溶解。

d)DNA從孔中漂浮出來。這通常是因?yàn)樽罱K樣本中殘留了C5溶液。在進(jìn)行凝膠電泳時，請注意步驟15的操作，避免將液體轉(zhuǎn)移至自旋過濾籃底部。乙醇沉淀（如所述“濃縮洗脫DNA”是去除殘留溶液C5的最好方法。

e)DNA儲存用溶液C6（10 mM Tris）洗脫DNA，必須儲存于−30至−15℃或−90至−65°C以防止降解。DNA可在TE中洗脫而不損失，但EDTA可能抑制PCR和自動測序等下游反應(yīng)。DNA也可在無菌的、不含DNA的PCR級水中洗脫（貨號17000-10)。

 

3.替代裂解法 

a)細(xì)胞難以裂解 

添加CD1溶液后，在進(jìn)行珠磨步驟之前，于65°C下孵育10分鐘。從步驟2開始繼續(xù)執(zhí)行方案。

b)降低DNA剪切

加入CD1溶液后，渦旋振蕩3-4秒，隨后加熱至70°C并保持5分鐘。重復(fù)一次該步驟。此替代方法可減少剪切力，但可能會降低產(chǎn)率。

 

九、儲存

溶液CD2應(yīng)在到達(dá)時儲存于2~8°C。DNeasy PowerSoil Pro試劑盒的所有其他組分和試劑

可在室溫（15~25°C）下儲存，直至包裝盒標(biāo)簽上打印的有效期。